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在ELISA實驗中，組織樣本的處理方法直接影響檢測結果的準確性。常見的處理方法包括以下幾種，具體選擇需根據目標蛋白的性質(如可溶性/膜蛋白)和實驗需求(如總蛋白/特定組分分析)而定：
1. 組織勻漿法
適用：大多數可溶性蛋白(如細胞因子、酶、信號分子)。
步驟：
取材：新鮮或冷凍組織切成小塊，預冷PBS沖洗去血液。
勻漿：
機械勻漿：使用勻漿器(如Polytron)或研磨杵(冰浴操作)。
液氮研磨：對堅硬組織(如骨骼、肌腱)更有效。
裂解緩沖液：
常用RIPA緩沖液(含蛋白酶/磷酸酶抑制劑)。
對脆弱蛋白可用溫和裂解液(如Tris-HCl + NP-40)。
離心：12,000×g, 4℃, 15-30分鐘，取上清(避免脂層和沉淀)。
注意：
保持低溫防止蛋白降解。
蛋白濃度需標準化(BCA/Bradford法)。
2. 分步離心法(亞細胞組分分離)
適用：研究特定細胞器(如線粒體、細胞核)中的蛋白。
步驟：
組織勻漿后，低速離心(500×g)去除細胞碎片。
逐步提高離心力(如10,000×g取線粒體，100,000×g取微粒體)。
各組分用裂解液溶解后檢測。
3. 酶消化法(適用于纖維組織)
適用：膠原豐富的組織(如皮膚、腫瘤)。
步驟：
用膠原酶、胰蛋白酶等消化(37℃, 30-60分鐘)。
終止消化后離心取上清。
4. 酸/有機溶劑提取法
適用：小分子肽(如神經遞質)、某些磷酸化蛋白。
步驟：
用TCA或丙酮沉淀蛋白，再中和溶解。
5. 特殊處理(膜蛋白/難溶蛋白)
去垢劑處理：SDS、Triton X-100溶解膜蛋白。
超聲破碎：輔助裂解(冰浴間歇超聲，避免過熱)。
關鍵注意事項
抑制劑添加：蛋白酶/磷酸酶抑制劑必加(如PMSF、cocktail)。
標準化：
按組織重量(mg/mL)或總蛋白濃度(μg/μL)調整樣本量。
避免過度稀釋導致低信號。
預實驗驗證：通過Western Blot或活性檢測確認目標蛋白未被降解。
示例流程(小鼠肝臟IL-6檢測)
取100 mg肝組織，液氮研磨成粉末。
加入1 mL RIPA裂解液(含抑制劑)，冰上勻漿。
4℃離心(12,000×g, 20分鐘)，取上清。
BCA法測蛋白濃度，用稀釋液調整至1 μg/μL。
按ELISA試劑盒要求加樣檢測。
根據目標蛋白的定位和穩定性，選擇合適方法可顯著提高檢測靈敏度!
注：以上資料僅供參考，不同品牌產品可能存在設計差異，操作前建議參考說明書。
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