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PCR實驗常見問題及解決方案
以下是天正信達(dá)PCR實驗常見問題及解決方案的系統(tǒng)性總結(jié)：
一、擴增失敗類問題
無擴增條帶?
酶失活：更換新酶或不同品牌酶制劑
模板問題：
• 含甲酸等雜質(zhì)(石蠟包埋樣本需特殊處理)
• 濃度不足(建議梯度稀釋驗證)
溫度異常：校準(zhǔn)PCR儀溫度，變性溫度建議93-94℃/1min
假陰性結(jié)果?
引物降解：PAGE電泳驗證引物完整性
抑制物干擾：純化模板或改用柱式提取試劑盒
退火溫度過高：梯度PCR優(yōu)化(推薦55-65℃范圍)
二、產(chǎn)物異常類問題
現(xiàn)象 主要原因 解決方案
非特異性條帶 引物二聚體/Mg2?濃度過高 降低引物量至0.1-1μM，調(diào)整Mg2?至1.5-2mM
拖尾/彌散 循環(huán)數(shù)過多/dNTP濃度偏高 減少循環(huán)至30-35次，dNTP濃度控制在200μM以下
產(chǎn)物量不足 延伸時間過短/模板量低 按1kb/min延長延伸時間，增加模板至50-100ng
三、污染與質(zhì)控
假陽性污染?
操作規(guī)范：
• 分裝試劑避免反復(fù)凍融
• 使用帶濾芯槍頭
環(huán)境控制：前/后PCR區(qū)域物理隔離
數(shù)字PCR優(yōu)化?
低頻突變檢測：結(jié)合預(yù)擴增技術(shù)可將靈敏度提升至0.1ppm
四、關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化
引物設(shè)計?：
• 長度18-27bp，GC含量40-60%
• 避免3'端互補(BLAST驗證特異性)
循環(huán)參數(shù)?：
變性94℃/30s → 退火(梯度優(yōu)化)→ 延伸72℃/1kb/min
注：白色孔板專用膜可提升低濃度樣本檢測信號強度
注：以上資料僅供參考，如需完整產(chǎn)品說明，建議聯(lián)系供應(yīng)商獲取最新版本.
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